河北医科大学硕士学位原真菌检测专业教师刘福英中文摘要

河北医科大学硕士论文《实验动物皮肤病原真菌核酸检测方法的建立》姓名：郑龙申请学位等级：硕士专业：生物化学与分子生物学导师：刘福英中文摘要实验动物皮肤病原真菌核酸检测方法摘要 目的：皮肤癣菌包括毛癣菌属（Tri）、小孢子菌属（Mi sp）和表皮菌属（ sp）三个属，其中大部分为人畜共患病原体真菌，可侵入皮肤、毛发和指甲，寄生或腐生于皮肤。表皮、头发和指甲板的角质组织，引起浅表真菌病。引起实验动物皮肤癣菌病的主要病原菌有须癣毛癣菌(Mi)、石膏小孢子菌(Mi)和犬小孢子菌(Mis)。这三种细菌是实验动物应排除的病原菌。无论是从动物皮损中分离出来还是从非皮损中分离出来，这三种细菌都被认为是异常的，因为非皮损中的真菌很可能在后期引起皮肤病，同时引起饲养和实验人员的感染。皮肤病原真菌的检测主要依靠对真菌培养物的菌落形态和真菌菌丝的显微镜观察。显微镜检查虽然很快，但需要多年的实践经验，难以识别物种。

其实真菌的表型特征很容易受到外界因素的影响，如温度变化、培养基成分、化学处理等，这些都会影响真菌的代谢过程，进而影响结果的观察。此外，一般需要2～3周才能获得典型的形态和显微特征。对于一些缺乏特定形态和微观特征的菌株，需要在特殊培养基中进行二次培养。 PCR技术具有特异性强、灵敏度高、快速等优点，已被用于皮肤癣菌的检测。目前大（Tri）中文文摘大多选择真菌通用引物对皮肤癣菌DNA的CHS基因、18S、25S、28S rRNA和rRNA的ITS区进行扩增，然后对扩增产物进行测序或使用限制性内切酶做RFLP用于细菌种属鉴定（PCR-RFLP），一些报道使用随机扩增DNA多态性（RAPD）直接鉴定皮肤癣菌的种属水平。但与医学有关的真菌有100多种。皮肤癣菌有几十种，目前还没有一种分子生物学方法可以快速、简便、准确地用于种级皮肤癣菌的鉴定。获得完整的核酸是应用PCR方法的前提。由于真菌细胞壁的坚固性，通常的提取方法不能得到真菌DNA。目前有多种真菌DNA提取方法的报道，如使用破壁酶 ocin、玻璃珠法、使用研钵研磨等，这些方法或所用材料较贵，或有对获得的 DNA 质量的影响；同时，传统的DNA提取过程繁琐、耗时，往往使工作人员劳累。

本实验的目的是设计一种快速简便的皮肤病原真菌DNA提取方法，建立一种快速、灵敏、特异的核酸鉴定方法，用于检测实验动物皮肤病原真菌。方法：将须发癣菌、石膏小孢子菌和犬小孢子菌标准菌株接种于沙氏斜面固体培养基中，27℃培养7天。无菌取少量须癣毛癣菌和石膏小孢子菌接种于沙氏液体培养基中，置于27℃恒温摇床上以80rpm/min摇动10天。将培养基倒入100ml离心管中，将离心沉淀置于1.5ml Ep管中。 70.C或液氮储存。取少量须毛癣菌和小孢子石膏的菌丝（约10rag）保存在液氮中，或用破壁酶或用研钵细磨，或用无菌牙签破坏菌丝，分别用苯酚氯仿和醋酸钾。异丙醇提取DNA：从犬小孢子倾斜固体培养基中刮取少量菌丝体，用破壁酶和醋酸钾-异丙醇提取DNA。选择皮肤癣菌通用引物（CH Sl1R）和随机引物（FM 1），通过PCR扩增鉴定3种皮肤癣菌1S、CH Sl中国抽象菌。结果 1 将石膏微孢子虫接种在几种沙氏斜面固体培养基上。培养2周后，在一些培养基上生长的菌落已变成淡黄色粉状菌落，而另一些仍为白色菌落。 2 DNA电泳结果表明，四种获得DNA的方法（方法1至4)均能获得完整、适量的DNA。

根据电泳图（图1~4)，方法一，用杵在研钵中研磨的方法有时会导致基因组DNA断裂：方法二，用无菌牙签破坏菌丝壁该方法整个过程耗时最短，但获得的DNA量较少：方法3，使用破壁酶的方法可以获得更多的基因组DNA，很少发生DNA降解；方法4，直接从培养基 取少量犬小孢子菌菌丝，用酶破壁的方法提取足够的DNA。 3 方法5，直接从固体培养基中刮下真菌菌丝，用无菌牙签破坏细胞壁后提取，没有得到真菌DNA。 4 用醋酸钾提取核酸DNA进行PCR，得到清晰的扩增产物电泳图谱（图2~4)。 5 测得DNA浓度约为90ng/ul， 260nm/2处的吸光度比80纳米）。 >1.7.6 皮肤癣菌通用引物（、CH11R）扩增了三种真菌的DNA片段，其中须癣毛癣菌约350bp，石膏小孢子菌约400bp，犬小孢子菌约440bp（图5).7随机引物FM l 扩增了3种真菌中不同大小的DNA片段，其中须癣毛癣菌主要扩增两条条带，大小约为500bp，另一条>1kb；石膏小孢子的主要扩增条带约为350bp； canis的大小只有一个扩增带，大小约为200bp中文摘要（图6).

结论 1. 四种从真菌基因组中提取 DNA 的方法（方法 1-4) 均提取了完整、适量的 DNA，其中直接从固体培养基中刮取菌丝体和使用破壁酶的方法）提取DNA）（该方法4)可以大大减少培养时间，缩短真菌检测时间，减少液体培养中过度操作造成污染的可能性。适用于大量样品的检测，最适用于实验动物皮肤病原真菌的检测及临床应用。皮肤癣菌的快速检测。2醋酸钾快速提取法提取的DNA用于PCR，产生清晰的扩增条带，可满足PCR扩增实验。与苯酚-氯仿法相比，该方法简单快速，是一种为PCR产生高质量DNA的DNA提取方法。3常见皮肤癣菌引物 (CHSI) 可增加真菌样本并初步鉴定皮肤癣菌。 4 随机引物FM l 用于真菌RAPD分析，可以结合三种常见的实验动物皮肤病原真菌须癣毛癣菌、石膏小孢子菌和犬小孢子菌相互鉴定。5 皮肤癣菌通用引物PCR与RAPD技术相结合可能成为一种有效的方法。实验室动物皮肤病原真菌的检测。 1S, CH Sl1R) 用于PCR扩增 关键词：皮肤病原真菌：真菌检测：PCR：RAPD；提取DNA； DNA 指纹 英文摘要 opm entof the on c derm ei c aci d i nl m ecti ve: Derm be cl assi fi ed into , Tri , M i derm ．Theyi nvade ni zed ti ssues of human and mal ,,ci fi ed皮肤层，hai rand nai l s，causi ci s．D erm hi li ontl m ai nl y Tri m ，M i i ai s．三种derm ato- d be tol anim al，nom erei sol ated i n i ous site tesor uni ous sites.softl m al ngi on toi nuni oussi tesw ngl an. si s and mi ci denti fi cati on rectl y from l esi on 以下是 n—虚拟的。 Al rapi i cal, mi cal Exam ini on i es- ots ence。事实上病原真菌的鉴定方法，stil yi nfl de ，例如 tem van' 、5 英文摘要 chem 和 edia，它们可能会与它们一起出现 - 体外培养结果。体外培养型生物化学 10～．然而，e sti cs ofm ogi atypi stic derm, i denti fi cati on m m edi a。这些测试将进行。 Per ogyw hi chi shi ti vity, 专门用于牙科。现在，这些研究扩大了皮肤的 D N A — sel ecti nguni m ersw hi、25S、28Sri bosom al RN 和 i 床 (ITS) 区域、asw el las chi tin 、 m y requi ti onal mani pul ati pl i fi cati onor cti on gesti on。 , pl i fi cati onand i denti fi cati on of D N queto a n esin RAPD 使 vari be di dl sel other.但也有各种 ed 汤姆 edi ci ne 和 . N i sno one mool bio ol ogy that to ty, sim pl i ci ． D erm 有 lw 所有 l s 都是传统的 D N A 。 N on m of derm ato- D N A, em (N ovobi oci n), gl me , w i th eet a1.这些是 D N A 或传统的 D N - m e- i ng，并让人们感觉很红。对核磁酸进行鉴定的试验开发法，具有特殊的敏感性，对皮肤有特殊的敏感性。 And to i sh arapi m pl eD N A i sol ati on cderm ato · nl m alby 比较 N A． M : strm ns (Tri enta-, M i i cani s)接种于27℃培养7天。然后 Tri m and M i erem edi umand i w i ng for 2TC。 n i qui dm ycel i al sampl col ． 5m 管在 l i qui d ni ．样品（约 10 m g）是通过溶解酶溶解的，或 nel yw i th ei n U ed m ortar 或 di usi ngai lck。然后 -chl on m on 方法用于 i sol ateD N A;Asm al ll um pofm ycel i aofM i s w aud , i sol ated D N Ausi ng l ysi ng enzym e -ic derm nl m al areal coh01.7 英文摘要由 PCR 与 m erFM 陆地统一体 c derm 区分。结果 t1 M i 与 i 接种的时间相同。两周后，一些生态区长得很亮，发黄，生长区变亮。 tshow ( m -4) canal l i sol ate sati sfi ed D N A.M , ycel i a fi nel yw i th ei n l l edm ortar, som eti m esm ake D N Adi ; 2, di m ycel i a usi l ck , edl i ttl etime, 但 tyof D N Aai 比其他 m 少； 方法 3，使用裂解酶、N A 和避免 D N A； 方法 4病原真菌的鉴定方法， 可以从少量样品中分离出足够的用于 PCR 的 D N A pofm ycel i a d (Fi gl ～4、．3 M ,asm all l l um pofm ycel i aw hi aud asdi usi nga steri lck, 然后 D N A. But no D N Aw as .4 DNA Were ng and w to PCR. el s di spl ays di sti nctam pl i fied 条带的结果 (Fi 92---4). 5 tyof D N Asol uti onis/Bl，A260 /A2so>1.7.6 Am pl i fi cati on of derm D N A w i th uni mers (CH Sl1R) yi el ded1S, CH Sldi ents. 8 英文摘要 Tri m as about 350bp, M i cro...