平板划线分离培养法对混有多种细菌的接种方法介绍

核心提示：大部分细菌都可以通过人工方法培养，只有培养出微生物才能进行研究、鉴定和应用。

接种和隔离方法

根据待测标本的性质、培养目的和所用培养基的类型液体培养方法，采用不同的接种方法。

1.平板划线培养法

对于混合菌，采用划线分离培养，沿划线将琼脂板表面原有的混合菌分离，得到分散的单菌落，得到纯种。板划线分离法通常有两种方法：

①分区与线分离法：此法常用于菌量较大的菌种分离。首先用接种环挑取标本，铺在琼脂板1区（占培养基总面积的1/4）并画好几条线，然后在2、中依次画线3、4 区域。每个区域标记后，接种环烧灼消毒一次，冷却后标记下一个区域。每个区域的标记交给前一个区域的标记1~3次。对于分区划线成功的平板，培养后观察1区菌苔形成，2区菌落连成一条线，3区和4区可分离出单个菌落。

②连续条痕分离法：此法常用于细菌含量少的标本或培养物中的细菌分离培养。方法是在1/5琼脂平板上轻轻涂抹接种物，然后用接种环或棉签在平板表面连续划出曲线，直至覆盖琼脂平板表面。

2.琼脂斜面接种法

主要用于菌落移植，获得纯种，用于菌株的鉴定和保存。用接种环（针）挑一个菌落或培养物，从培养基斜坡底部向上画一条直线，然后从底部到斜坡顶部曲折向上。将生化鉴定培养基接种在斜面上，用接种针挑取待鉴定菌落，从斜面中心垂直刺入底部，然后抽出接种于斜面上。从下到上的曲折线。

3.穿刺接种

此法多用于半固体培养基或二糖铁、明胶等高层培养基的接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力学。接种时，用接种针挑菌落，从培养基中心垂直刺入距管底0.4cm，然后沿穿刺线拔出接种针。对于具有高层和斜面的培养基，如二糖铁，刺破高层部分，退出接种针后直接在斜面部分划线。

4.液体培养基接种

用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等各种液体培养基的接种。挑取带有接种环的单个菌落，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物（试管直立后液体浸没接种物）。这种接种方法应避免接种回路与液体过度接触，不得在液体中混合搅拌，以免形成气溶胶，造成实验室污染。

5.倒板法

该方法主要用于饮用水、饮料、牛奶等标本中的细菌计数。取 1ml 稀释或原样的纯培养物放入无菌培养皿中，然后将 15-20ml 融化并冷却至约 45-50°C 的琼脂培养基倒入无菌培养皿中，充分混匀，待凝固 37℃培养细胞，待菌落生长后计数菌落，得到每毫升标本所含细菌数。先数6个方格（每个方格为1cm2）内的菌落数，求出每平方的平均菌落数，算出盘子的直径，然后按下式数数，求出菌落数每毫升标本的细菌数。

全盘菌落数=每平方平均菌落数×лr2

每毫升标本中的细菌数=整个平板上的菌落数×稀释倍数

6.涂层孕育法

这种方法多用于细菌接种，采用圆盘扩散法进行药敏试验。在琼脂培养基表面加入一定量或适量的菌液，然后用消毒过的L型玻璃棒或棉签以不同角度反复涂敷，使接种液均匀分布在培养基表面。琼脂，然后贴药。敏感纸片，或直接培养，此法培养后细菌形成菌苔。

细菌培养法

根据不同的标本和不同的培养目的，可以选择不同的培养方法。细菌的培养方法通常分为好氧培养、二氧化碳培养、微需氧培养和厌氧培养四种。

1.有氧培养

是指在好氧条件下培养好氧菌或兼性厌氧菌。接种后的平板、斜面、液体培养基等在空气中35℃培养箱中培养18~24小时。没有特殊要求。细菌可以生长。一些生长缓慢的细菌需要培养3-7天甚至1个月才能生长。要在培养箱中保持一定的湿度，请在其中放一杯水。对于培养时间较长的培养基，接种后试管口用棉塞或硅胶塞塞住，然后用石蜡-凡士林密封，以防培养基变干。

2. 二氧化碳培养

一些细菌在最初分离时，必须在 5% 到 10% 二氧化碳的环境中培养才能生长。常用的栽培方法如下。

①二氧化碳培养箱法：二氧化碳培养箱可以自动调节二氧化碳的含量、温度和湿度。将培养物置于培养箱中，培养一定时间后可直接观察生长结果。

②蜡烛罐培养法：取标本罐或带盖玻璃干燥器液体培养方法，将接种过的培养基放入罐内，点燃蜡烛，置于罐内培养物略高的位置，盖上盖子或瓶口。罐。全部涂上凡士林并密封。由于筒内蜡烛的氧气逐渐减少，几分钟后蜡烛自行熄灭。此时容器内的二氧化碳含量约占5%~10%。将罐子在 35°C 的普通培养箱中培养。

③气囊法：选用无毒透明的塑料袋，将装有接种标本的培养皿放入袋中，尽量排除袋内空气，折起开口，用弹簧夹夹住袋口。使袋子密闭，并切断袋子内安装的二氧化碳气管管（安瓿）以产生二氧化碳。几分钟内即可达到所需的二氧化碳培养环境，在35°C的培养箱中培养。

④化学法：常用碳酸氢钠-盐酸法。称取每升体积碳酸氢钠0.4g和浓盐酸0.35ml的比例，分别放入容器中，与容器一起放入玻璃圆筒中，盖紧密封，倾斜气缸位置使盐酸与碳酸氢钠接触生成二氧化碳。在 35°C 培养箱中培养。

3. 微需氧培养

微需氧培养物不能在大气或绝对厌氧环境中生长。它们只能在含有5%-6%氧气、5%-10%二氧化碳和85%氮气的气体环境中生长。将标本接种到培养物中。将底物置于上述气体环境中，35℃培养，即微需氧培养法。

4. 厌氧培养

厌氧菌对氧气很敏感，在培养过程中需要创造一个氧化还原电位低的厌氧环境。厌氧培养常用的方法有：物理法、化学法和生物法。如厌氧罐培养法、气囊法、厌氧手套箱法、好氧菌共生厌氧法等。

培养基上的细菌生长特征

1.固体培养基标本或液体培养物在固体培养基表面划线后，单个细菌可通过分裂繁殖形成可​​见的菌群，称为菌落()。

①菌落形态特征：大小、形状（露珠状、圆形、菜花状、不规则等）、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、波浪状、锯齿状、卷曲等）、颜色（红色、灰白色）等），黑色，绿色，无色，黄色等），表面（光滑，粗糙等），透明度（不透明，半透明，透明等）和粘度等。根据不同的表面特性细菌菌落，菌落可分为3种类型：

A. 光滑菌落（S型菌落）：菌落表面光滑、湿润，边缘整齐。大多数新分离的细菌是光滑的菌落。

B、粗糙型菌落（R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、起皱或呈颗粒状，边缘多不规则。R 型菌落主要由 S 型细菌突变和失去表面多糖或蛋白质形成。R型细菌抗原不完全，毒力和抗吞噬能力弱于S型细菌。然而，也有一些新分离的 R 型毒株，如炭疽杆菌和结核分枝杆菌。

C.粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠，有光泽，呈水滴状。多见于包膜厚或粘液层丰富的细菌、结核杆菌等。

②集落溶血的特点：集落溶血有以下三种情况。

α溶血：又称草绿色溶血，菌落周围培养基中出现1-2毫米的草绿色环，由高铁血红蛋白引起；

β溶血：又称完全溶血，在菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是由细菌产生的溶血素完全溶解红细胞引起的；

γ溶血：没有溶血，菌落周围的培养基没有变化，没有红细胞溶解或损失。

③色素：部分细菌产生水溶性色素，使菌落及周围培养基呈现绿色、金色、白色、橙色、柠檬色等颜色，产生的色素为水溶性或脂溶性。

④ 气味：有些细菌在培养基中生长繁殖后会产生特殊气味，如绿脓杆菌（姜味）、变形杆菌（巧克力焦味）、厌氧梭菌（腐臭味）、白色念珠菌（酵母）和放线菌（泥土味） ）。

2、液体培养基中的细菌在液体培养基中有三种生长现象：大部分细菌在液体培养基中生长繁殖后呈均匀浑浊；少数链球菌、炭疽杆菌等链状菌呈沉淀生长；枯草芽孢杆菌 专性需氧菌如芽孢杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌一般在表面生长，并经常形成生物膜。

3.半固体培养基

半固体培养基主要用于细菌动力学测试。除了沿着穿刺线生长带有鞭毛的细菌外，穿刺线两侧还可以看到羽毛状或云状生长。没有鞭毛的细菌只能沿穿刺线以明显的线状生长，穿刺线两侧的培养基仍清晰透明，动力学试验为阴性。

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