幽门螺杆菌液体培养方法及检测将已培养的主要病因

单位：重庆第三军医大学临床微生物学系、医学检验系，

关键词：幽门螺杆菌；液体培养

第三军医大学学报

摘要目的：探索一种简便的培养幽门螺杆菌（Hp）的液体培养方法。方法：用组织培养瓶装入少量含有10%小牛血清、0.5%淀粉、10 mg/L万古霉素和2 500 U/L多粘菌素B的脑心浸液肉汤。厌氧池通过通风建立微需氧环境，37℃摇动培养，平板菌落计数法检测生长情况。结果：培养24-48小时后，液体中活菌量大于/ml，涂片染色菌形态典型。结论：该Hp液体培养方法简单可行，细菌生长良好，可满足Hp毒力因子和细菌成分研究的需要。

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CLC 编号 R446.5

目前，幽门螺杆菌(Hp)已被公认为慢性胃炎和消化性溃疡的主要原因，与胃癌的发生密切相关[1]。 Hp的检测技术发展迅速，但Hp的液体培养问题并没有完全解决。虽然国外已经报道了几种H. 液体培养的方法[2, 3]，但操作复杂，国内还没有这方面的报道。为此，我们在国外报道的方法基础上进行了改进液体培养方法，建立了成熟、简单、实用的Hp液体培养方法。

1 材料与方法

1.1株

本实验室从临床胃病患者胃镜活检组织中分离培养Hp、Hp和Hp菌株，经染色、脲酶试验和PCR鉴定，液氮保存。胃镜标本取自我校附属医院胃镜室。

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1.2 方法

1.2.1株Hp固体培养菌株分别接种于脑心浸液血琼脂平板上，培养基含TMP 5 mg/L、万古霉素10 mg/L、 B2500 U/L , 接种于玻璃厌氧罐中, 采用抽气法建立微需氧环境(10% CO2, 5% O2, 5% H2 和80% N2), 37℃培养)。孵化器。

1.2.2 液体培养与检测 取出48小时H。为了制备浓度为3×108/ml的标准菌悬液，快速转移10μl至在 100 ml 组织培养瓶中加入 10 ml 液体培养基（脑心浸液肉汤，含有 10% 小牛血清、0.5% 淀粉、100 mg/L 万古霉素和 2 500 U/L 多粘菌素 B），轻轻塞住棉塞，水平放置在厌氧罐中并抽吸以建立微生物。好氧环境，然后将广口瓶放入稍加改造的盖子的恒温摇床（THZ-C，江苏太仓实验设备厂）中，37℃（100 r/min）摇动培养，每天开瓶涂片革兰染色检查，平板菌落计数法[4]检测活菌数并监测生长情况。

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2 个结果

所有三种细菌菌株都在这种液体培养基中生长良好。 Hp和Hp两种菌株在摇动培养24小时后达到较高的活菌浓度（>/ml），Hp菌株已培养48小时。浓度也达到这个水平，见图1。此时涂片染色呈典型的细菌形态，呈螺旋状，偶见长丝状。维持2-3天后，活菌水平开始下降。涂片染色显示部分细菌形态不典型，颜色较浅，出现革兰氏阴性球体，如图2所示。随着培养天数的增加，活细胞数减少，球体数开始增加.

图1 3株幽门螺杆菌在脑心浸液肉汤中的生长曲线

, 百舒药业 图2 幽门螺杆菌在液体培养中的细菌形态（革兰氏染色×1 000)

a：培养2天后的细菌是典型的，呈螺旋状； b：培养4天后菌体颜色苍白，形态不典型，呈球状体

3 讨论

Hp的分离培养方法已经非常成熟，但由于气体条件恶劣，液体培养受到很大限制。我们根据国外文献报道的方法和我实验室的工作经验建立的这种培养方法充分体现了气液接触面大。液体的表面积大大增加，摇晃后气体可以充分分散在液体中，可以更好地促进Hp的生长。国外资料报道，几种液体培养基（如布氏肉汤、哥伦比亚肉汤、MH肉汤和脑心浸液肉汤）可以满足幽门螺杆菌的生长条件，但脑心浸液肉汤加小牛血清的生长最好[5， 6]，这与我们的结果一致（数据待发表）。另外，添加0.5%淀粉可以有效吸附细菌生长过程中的代谢毒物，有利于Hp的生长。幽门螺杆菌液体培养的另一个限制因素是污染。我们根据固体培养基中抗生素的浓度在肉汤中添加万古霉素和多粘菌素B，很好地控制了污染的发生，不影响幽门螺杆菌的生长。

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从培养第4天开始，液体中的活菌数开始减少，涂片染色观察到随着活菌数的减少，Hp的形态也发生了变化。从典型的细长螺旋形变为球形，可能是由于代谢物的积累和营养物质的消耗导致生存环境的恶化。

近年来，幽门螺杆菌疫苗成为研究热点，各种毒力因子、细菌成分和免疫原的制备都需要通过幽门螺杆菌的液体培养获得。该方法仍局限于小规模培养，进行大规模Hp液体发酵培养尚需进一步探索和改进。

（感谢新桥医院消化内科张鹏斌医生对标本采集的大力帮助！）

国家重点科技攻关项目，NO.96-901-01-54

作者简介：郭刚，男，29岁，硕士

参考文献

1范学功，夏华祥。幽门螺杆菌感染：基础和临床。长沙：湖南科学技术出版社液体培养方法，1997.19～25

，白术药

2 夏 H X、L、Leane C T 等。在媒体中。临床杂志, 1993, 46(8):750

3 M、E、L 等。快速大规模的 in 和 .应用, 1995, 61(6):2431

4 J R. 上。 : 按,1969.611～628

5 Lin Y L、Lee N、Chan E C 等。的为 。临床杂志,1996,49(4):818

6 M、麦 UEH、H 等人。的媒体。临床杂志,1991,29(12):2835

（收稿：1998-06-23；修订：1998-12-09)，白术医药